La Sala del Tesoro, che prende il nome dalla sua funzione di sede dell’erario e di luogo per la conservazione di documenti ed oggetti preziosi, è un'aula circolare. Sovrapposta alla Sala della Giustizia, costituiva originariamente un unico vano con la sovrastante Sala Rotonda. Alcuni studiosi la identificano con la vera cella sepolcrale dell'imperatore Adriano. Il sarcofago in porfido che forse ne custodiva le spoglie e che qui si sarebbe trovato, rimaneggiato da Carlo Fontana nel 1698, è oggi il catino battesimale della Basilica di S. Pietro.
La sala ha assunto un aspetto poligono nel 1545, quando Paolo III Farnese (1534-1549) fece ancorare alla muratura la finta architettura degli armadi in noce per conservarvi l'Archivio dello Stato Pontificio e l'Archivio Segreto (Archivum Arcis).
La prima notizia di una riserva aurea conservata nella fortezza risale alla fine del Quattrocento; in seguito fu Sisto V Peretti (1585-1590) a collocare qui nel 1586 l’Erario sanziore, custodito insieme a numerosi oggetti preziosi, come le Mitre ornate di gemme e i Triregni dei pontefici, chiusi in cassoni di ferro.
La stanza era chiusa da due porte le cui chiavi erano custodite una dal Tesoriere Segreto del Papa, l’altra dal Cardinal Decano. Il ‘tesoro’ era riposto nel grande forziere, tuttora al centro della sala, accessibile mediante l’apertura di ben sei serrature, i cui ingegni erano affidati a persone diverse. L'ultimo prelievo dall'erario di ciò che restava dei tre milioni di scudi depositati due secoli prima fu eseguito nel giugno del 1796. Nel corso del XIX secolo la sala fu poi trasformata in prigione. A testimoniarlo restano gli appunti, le memorie, le imprecazioni lasciate dai detenuti a ricordo delle loro vicende umane, come l'iscrizione leggibile all'interno di uno sportello, che reca l'elenco dei romanzi storici letti da uno dei reclusi.